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Mesure de la translocation d’antibiotiques à travers les porines par résonance paramagnétique électronique

ABG-121491 Stage master 2 / Ingénieur 6 mois 670 euros
02/04/2024
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Aix-Marseille Université
Marseille Provence-Alpes-Côte d'Azur France
  • Biochimie
02/09/2024

Établissement recruteur

Présentation de l'université

Plus grande université francophone pluridisciplinaire, Aix-Marseille Université (AMU) accueille 80 000 étudiants et près de 8 000 personnels sur 5 grands campus aux standards internationaux. Propriétaire de 90 % de son patrimoine, l’université est présente sur 9 villes, dans 4 départements de la Région Sud.
Sa Fondation universitaire A*Midex, qui porte l’IDEX pérennisée, contribue au développement d’un pôle interdisciplinaire d’enseignement supérieur et de recherche de rang mondial. Dite « université de recherche intensive » elle abrite 122 structures de recherche en lien avec les grands organismes de recherche nationaux.

Présentation de l'institut thématique IM2B

L'IM2B vise à favoriser de nouvelles collaborations à l’échelle locale, nationale et internationale, en étroite interaction avec les partenaires industriels et les collectivités territoriales. Comprendre la diversité et le fonctionnement du monde microbien, que ce soit à l’échelle de la molécule, de la cellule, de l’écosystème ou par son association étroite avec les autres organismes (végétaux, microbiotes…), représente une source de connaissances scientifiques indispensable au développement de solutions biotechnologiques pour la production d’énergie, l’environnement et la santé. Dans ce contexte et avec ces objectifs, l'IM2B réunit les acteurs de ce domaine en recherche et formation interdisciplinaires, ainsi qu’un réseau de plateformes technologiques de premier plan, pour renforcer notre visibilité et notre attractivité internationale.

Formation

L’IM2B met en place son PhD program à destination des doctorants issus des différents champs disciplinaires pour les former à une recherche collaborative et interdisciplinaire, et pour créer une culture d’institut propice au développement de nouveaux thèmes de recherche et de technologies innovantes. Il organise (i) grâce à son réseau de plateformes technologiques, une formation aux technologies de pointe pour les étudiants en Master et les doctorants ou pour les professionnels (formation continue), (ii) l’internationalisation des masters par des cours en anglais, la mobilité internationale et la co diplomation, (iii) l’organisation d’écoles d’été interdisciplinaires.

Masters concernés : Microbiologie (y compris un co-diplôme avec l’Université « La Sapienza »); Biologie structurale et génomique ; Biologie et biotechnologies environnementales, Qualité et sécurité en alimentaire ; Chimie pour le vivant ; Génie biologique de Polytech Marseille.

Recherche

Chaque année, l’institut met en place un appel d’offres pour impulser une recherche interdisciplinaire et assumer une réelle prise de risque à travers des financements d’amorçage et des thèses inter-laboratoires. Il met l’accent sur l’amélioration de l’accueil des chercheurs de haut niveau (soutien financier aux chercheurs et enseignants-chercheurs nouvellement embauchés). De plus, il favorise la mise en réseau des plateformes technologiques pour que la communauté scientifique bénéficie pleinement de ces infrastructures et ait accès à des équipements et des compétences de pointe pour ses travaux de recherche.

Attractivité / international

Le recrutement des étudiants de niveau master, doctorat et post-doctorat repose pour une part importante sur des candidats étrangers, en particulier ceux de l’alliance CIVIS, une Université Civique Européenne, et des autres universités partenaires. L’organisation d’une université d’été internationale renforce le rayonnement de l’Institut.

Innovation & ancrage socio-économique et culturel

L’institut coordonne et renforce les compétences pour créer des conditions favorables au développement de nouvelles technologies liées à l’énergie, l’environnement et à la santé, et/ou à la chimie bio-sourcée et bio-inspirée. Il met à la disposition des partenaires industriels des infrastructures de pointe (28 plateformes technologiques, 35M€ d’investissement et 35 ingénieurs), pour la réalisation de contrats de recherche, de collaborations partenariales ou de prestations de services. L’IM2B se veut être un portail incontournable pour les collectivités et les industriels dans le domaine de la valorisation du carbone renouvelable pour la chimie verte et l’énergie, et plus particulièrement les bioénergies.

Description

Laboratoires : Membranes et Cibles Thérapeutiques (MCT) Inserm U1261, UMR_MD1 ; Bioénergétique et Ingénierie des Protéines (BIP) CNRS UMR 7281

Equipes d’accueil : MCT/BIP07 Biophysique des métalloprotéines

Responsables du stage : Muriel Masi (Ph.D. HDR MCU AMU, MCT) ; Marlène Martinho (Ph.D. HDR MCU AMU, BIP)

Adresses : Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, 13005 Marseille ; 31 Chemin Joseph Aiguier, 13400 Marseille

Titre : Mesure de la translocation d’antibiotiques à travers les porines par résonance paramagnétique électronique (RPE)

 

Etat actuel des connaissances sur le sujet :

La résistance bactérienne aux antibiotiques représente une menace croissante pour la santé humaine et animale dans le monde entier. En Europe, celle-ci est responsable d’environ 25 000 morts par an ; et les frais médicaux associés aux coûts sociaux qui en résultent sont estimés à quelques 1,5 milliards d’euros par an. De nouvelles formes de résistance apparaissent et se répandent, laissant aux cliniciens peu de possibilités pour contrôler les infections. En même temps, malgré le besoin reconnu de développer de nouvelles molécules efficaces, la réalité est telle que seulement deux nouvelles classes d’antibiotiques ont été introduites sur le marché au cours de ces trois dernières décennies. Sur le plan scientifique, il est urgent de mieux comprendre comment les antibiotiques fonctionnent, comment la résistance se développe, et quels mécanismes moléculaires pourraient être exploités pour détourner la résistance bactérienne. Entre 2013 et 2018, le programme de recherche européen IMI-TRANSLOCATION visait à mieux comprendre le transport et l’accumulation des antibiotiques ainsi que l’émergence de la multirésistance chez les bactéries à Gram-négatif problématiques appartenant au groupe de pathogènes ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.). Des résultats significatifs ont été obtenus concernant (i) la translocation des antibiotiques à travers les porines générales de la membrane externe ; (ii) l’impact des pompes d’efflux sur l’accumulation et l’activité des antibiotiques chez les entérobactéries.

 

Problématique du projet proposé et approche rationnelle :

L’efficacité des antibiotiques dépend de leur capacité à s’accumuler à l’intérieur des bactéries jusqu’à ce qu’ils atteignent une concentration seuil pour interagir avec leur(s) cible(s) et inhiber leur activité. Cependant, la membrane externe des bactéries à Gram négatif est très imperméable et les antibiotiques diffusent à travers le canal étroit des porines. Mais ils sont en même temps des substrats de pompes d'efflux transmembranaires qui les expulsent1. Ainsi, de nombreux isolats cliniques multirésistants aux antibiotiques présentent des modifications fonctionnelles ou une perte des porines, associées à une surproduction de pompes d’efflux.

Les porines représentent une fraction substantielle du nombre total de protéines OM et favorisent la diffusion de solutés d'une masse moléculaire allant jusqu'à 600 Da. E. coli produit deux principales porines générales : OmpC et OmpF1. Les canaux OmpF/C présentent une forme de sablier, la partie la plus étroite étant appelée zone ou région de constriction (ZC) en raison du repliement de la boucle L3. La boucle L3 génère également un fort champ électrique transversal à travers la ZC, résultant d'une rangée de résidus chargés positivement sur la paroi du tonneau faisant face à des résidus chargés négativement sur la boucle L3. Ce champ électrique a des conséquences directes sur la perméation moléculaire2. Les structures de plusieurs orthologues OmpF/C ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Malgré des similitudes structurales, les porines OmpC possèdent un rayon de pores plus petit, une conductance plus faible, une sélectivité cationique plus élevée et une intensité de champ électrique transversal plus faible. Les expériences de prédiction des perméabilités et de gonflement des liposomes ont montré que la charge atomique et la taille des solutés constituent des limitations majeures à leur diffusion à travers les porines3. Nous avons récemment montré que la ceftazidime (CAZ), qui présente une charge négative nette, est active sur les bactéries exprimant les porines OmpF. En revanche, le céfépime zwitterionique (FEP) tue les bactéries quelle que soit la porine exprimée. La quantification des molécules accumulées par chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) et les expériences sur des systèmes isolés ont confirmé que CAZ présente une préférence pour OmpF pour pénétrer dans les bactéries4.

La spécificité des porines vis-à-vis des antibiotiques est une question importante pour l’efficacité des antibiotiques et le développement de nouvelles molécules antibactériennes. Ici, notre objectif est de développer une approche utilisant la biochimie des protéines et la biophysique (Site-directed spin labeling (SDSL) Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy) afin de mesurer des différences d’affinité entre molécules antibactériennes et les porines. Les porines purifiées Omp35 et Omp36 de K. aerogenes seront reconstituées dans des liposomes selon un protocole favorisant l’orientation « outside-out ». Dans un premier temps, l’orientation de ces porines sera testée. Pour cela, des substitutions en cystéine seront réalisées dans des boucles extra- et intracellulaires des deux porines. La fonctionnalité et la structure globale de tous les mutants générés et purifiés seront analysés par des tests phénotypiques in vivo et par dichroïsme circulaire in vitro. Les protéoliposomes contenant ces variants reconstitués seront alors incubés avec un fluorophore spécifique des cystéines, et extincteur de fluorescence imperméable aux membranes en absence ou en présence de détergent5. De la même façon, l’extinction du signal RPE de la protéine marquée avec un marqueur de spin de type nitroxyde sera étudiée en fonction de l’orientation de la protéine. Une analyse biophysique complète (taille, hétérogénéité) sera réalisée sur les protéoliposomes formés avant et après incorporation de la protéine marquée (sonde fluorescente ou sonde nitroxyde) par diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Light Scattering, DLS).

Dans un second temps, les changements de conformation potentiels des porines Omp35 et Omp36 en présence d’antibiotiques seront analysés. Pour cela, nous avons sélectionné des acides aminés dans Omp35 et Omp36 situés en dessus et en dessous de la ZC qui seront individuellement substitués en cystéine pour un marquage avec une sonde magnétique. Tous les mutants ont été générés par mutagenèse dirigée en utilisant les plasmides pColdIV-omp35/36 comme matrices et exprimés dans BL21Δomp8. Les niveaux d'expression des mutants ainsi que leur localisation correcte à la membrane externe seront testés avant purification par chromatographie échangeuse d'ions (protocole interne MCT). En parallèle, les mêmes mutations seront générées dans les plasmides pBAD24-omp35/36 pour confirmer qu'elles n'affectent pas la sensibilité aux antibiotiques chez E. coli K12. Les protéines mutantes Cys seront marquées avec une sonde nitroxyde et les spectres RPE seront analysés en l'absence et en présence d'antimicrobiens (FEP et CAZ). Des changements spectraux sont attendus si l’antibiotique entre en contact avec la sonde nitroxyde et établit des interactions favorables lui permettant de traverser la région de constriction et d'atteindre la sortie du canal6-8. Le résultat positif de ces expériences fournira un test in vitro rapide et puissant pour cribler toute une bibliothèque chimique d'antimicrobiens et déterminer la capacité de certaines molécules à pénétrer à travers les porines des entérobactéries.

 

Techniques utilisées :

-              Microbiologie : détermination de concentrations minimales inhibitrices

-              Biochimie : purification et reconstitution de protéines membranaires en protéoliposomes et tests d’orientation

-              Biophysique : SDSL-EPR, CD, DLS

 

Références bibliographiques :

  1. Masi M, Réfrégiers M, Pos KM, Pagès JM. Mechanisms of envelope permeability on antibiotic influx and efflux in Gram-negative bacteria. Nat Microbiol. 2017, 2:1700
  2. Vergalli J, Bodrenko I, Masi M, Moynie L, Acosta-Gutiérrez S, Naismith JH, Anne Davin-Régli, Ceccarelli M, van den Berg B, Winterhalter M, Pagès JM. Porins and small-molecule translocation across the outer membrane of Gram-negative bacteria. Nat Rev Microbiol. 2019, 18:164-76.
  3. Acosta-Gutiérrez S, Ferrara L, Pathania M, Masi M, Wang J, Bodrenko I, Zahn M, Winterhalter M, Stavenger RA, Pagès JM, Naismith JH, van den Berg B, Page MGP, Ceccarelli M. Getting drugs into Gram-negative bacteria: rational rules for permeation through general porins. ACS Infect Dis. 2018, 4:1487-98.
  4. Masi M, Vergalli J, Ghai I, Barba-Bon A, Schembri T, Nau WM, Lafitte D, Winterhalter M, Pagès JM. Cephalosporin translocation across enterobacterial OmpF and OmpC channels, a filter across the outer membrane. Commun Biol. 2022, 5:1059.
  5. Deutschmann S, Rimle L, von Ballmoos C. Rapid estimation of membrane protein orientation in liposomes. Chembiochem. 2022, 23:e202100543.
  6. Martinho M, Fournier E, Le Breton N, Mileo E, Belle V. Electron Paramagnetic Resonance. The Royal Society of Chemistry. 2018, 26:-88.
  7. Di Cesare M, Kaplan E, Rendon J, Gerbaud G, Valimehr S, Gobet A, Ngo TT, Chaptal V, Falson P, Martinho M, Dorlet P, Hanssen E, Jault JM, Orelle C. The transport activity of the multidrug ABC transporter BmrA does not require a wide separation of the nucleotide-binding domains. J Biol Chem. 2024, 300:105546.
  8. Bizet M, Byrne D, Biaso F, Gerbaud G, Etienne E, Briola G, Guigliarelli B, Urban P, Dorlet P, Kalai T, Truan G, Martinho M. Structural insights into the semiquinone form of human Cytochrome P450 reductase by DEER distance measurements between a native flavin and a spin labelled non-canonical amino acid. Chemistry. 2024, 26:e202304307.

Profil

Master 1 en biologie/microbiologie/biochimie.

Le (la) candidat(e) doit avoir une solide formation en biologie moléculaire, en biochimie des protéines et en biologie structurale, avec une première expérience pratique (stage de master 1) dans l'un de ces domaines. Le (la) candidat(e) doit témoigner d'un intérêt profond pour ce domaine de recherche, de bonnes aptitudes à la communication orale et écrite, des capacités d'analyse et de résolution de problèmes, et faire preuve d'esprit critique.

Prise de fonction

06/01/2025
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