Bases structurales du ciblage de NONO dans les cancers de la prostate, du sein. // Structural basis of NONO targeting in prostate and breast cancers

La famille DBHS comprend les 3 protéines SFPQ, NONO et PSCP1 présentant des homologies de séquence fortes. Ces protéines sont associées à de nombreux processus cellulaires, notamment l'épissage des pré-ARNm, la régulation de l'expression des gènes contrôlée par des miARN, le rythme circadien, la réparation de l'ADN, le métabolisme cellulaire, l'immunité innée contre l'infection par le VIH-2 et la formation de paraspeckles (1).

Pour effectuer leurs fonctions, ces trois protéines s'associent entre elles en homodimères et en hétérodimères, donnant lieu à une combinatoire de 6 complexes différents, du moins in vitro. Jusqu'à présent, on ne sait pas s'il existe une spécificité de fonction associée à un dimère ou l'autre in vivo.
Les protéines DBHS interagissent avec des acides nucléiques variés, notamment l'ADN double brin, l'ARN simple et double brin et les quadruplexes d'ARN. Cette interaction sert soit à fixer l'ARN et à maintenir un échafaudage en 2D (paraspeckles avec l'ARN lnc NEAT1_2), soit à s'associer aux ARN dans la réaction d'épissage par exemple. Même si les protéines DBHS portent des motifs classiques de liaison à l'ARN (RRM) connus pour interagir avec l'ARN, il est inhabituel qu'une seule protéine interagisse avec une telle variété d'ARN différents. Dans la plupart des études, les protéines DBHS utilisées étaient des versions tronquées des parties N- et C-terminales, éliminant les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) et conservant le cœur de la structure repliée. Cependant, des analyses récentes ont commencé à révéler le rôle des régions N-ter et C-ter sur les propriétés biophysiques de la protéine (2), ce qui incite à réévaluer les protéines complètes.

Récemment, grâce à un criblage de ligands sur des cellules de cancer de la prostate, le laboratoire de B. Cravatt au Scripps Institute (États-Unis) a identifié NONO comme la cible d'un ligand formant un adduit covalent sur le résidu de cystéine 145 non conservée (3). Dans leur étude, les auteurs montrent que l'adduit covalent renforce l'interaction protéine-ARN. Cette modification chimique de la protéine perturbe le cycle normal d'expression génique et prévient la progression tumorale dans le cancer de la prostate et du sein.

Dans ce projet de thèse, nous proposons d'explorer plusieurs aspects inconnus de la fonction cellulaire des protéines DBHS. Nous visons à déchiffrer les détails moléculaires du ciblage de NONO par des adduits chimiques dans le contexte des cellules cancéreuses (de la prostate) en résolvant la structure de NONO modifiée par des ligands. Nous explorerons également les propriétés de liaison à l'ARN du NONO en présence et en l'absence de ligand afin de comprendre le mécanisme moléculaire de l'amélioration de la liaison à l'ARN. Cet aspect spécifique sera idéalement étendu aux autres dimères DBHS. Dans l'ensemble, la lumière sera faite sur une question fondamentale concernant la reconnaissance de l'ARN par les DBHS, mais aussi sur le mécanisme ubiquitaire de la reconnaissance de l'ARN par les RRMs.

Le/la candidat/e au doctorat appliquera des méthodologies telles que les méthodes de biologie moléculaire et de biochimie pour la préparation et la caractérisation des protéines/ARN. Il/elle sera également impliqué(e) dans l'analyse biophysique de ces échantillons via une large gamme de techniques disponibles et adaptées telles que la diffraction des rayons X, BLI, MST....
Ces aspects biophysiques seront complétés par des techniques de biologie cellulaire dans le cadre de notre collaboration.
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DBHS family comprises three highly homologous, but distinct, proteins namely SFPQ, NONO and PSPC1, that are conserved in a limited number of higher organisms. These proteins have been associated to many different processes in the cell including pre-mRNA splicing, miRNA gene-expression regulation, circadian rhythm, DNA repair, cell metabolism, innate immunity against HIV-2 infection and formation of paraspeckles (1).

In order to fulfill their biological functions, these three proteins self-associate as homodimers and heterodimers giving rise to a portfolio of six possible complexes, at least in vitro. So far, it remains elusive whether there is a specificity associated to a peculiar dimer in vivo. The DBHS proteins interact with a variety of nucleic acids including double-stranded DNA, single and double-stranded RNA and G4 RNA quadruplexes. This interaction serves either to tether RNA and maintain a 2D scaffold (in paraspeckles with the lnc RNA NEAT1_2), or to associate to RNAs in splicing reaction for example. Even though DBHS proteins harbor classical RNA-binding motifs (RRMs) known to interact with RNA, it is unusual that a single protein interacts with such a variety of different RNAs.

In most studies, the DBHS protein used were either/or N- and C-terminal truncated versions of the full-length protein removing the so-called IDR (Intrinsically Disordered Regions) and keeping the core-folded structure. However, recent analysis started to reveal a role for the N-ter and C-ter regions on the protein behavior/biophysical properties (2) pushing towards the reassessment of the complete proteins.

Recently, through an unbiased ligand screening on prostate cancer cells, B. Cravatt's lab at the Scripps Institute, USA identified NONO as the target of a ligand that forms a covalent adduct on the non-conserved cysteine residue 145 of NONO (3). In their study, the authors showed that the covalent adduct reinforces the protein-RNA interaction and this is preventing prostate cancer progression by an unclear mechanism.

In this PhD project, we propose to explore several unknown aspects of DBHS cellular function. We aim at deciphering the molecular details of NONO targeting by chemical adducts in the context of (prostate) cancer cells by solving the structure of ligand-modified NONO by X-ray crystallography. We will also explore the RNA binding properties of NONO in the presence and in the absence of ligand in order to understand the molecular mechanism of RNA-binding enhancement. This specific aspect will ideally be expanded towards the other DBHS dimers. Altogether shedding light on a fundamental question regarding DBHS RNA recognition but also on the ubiquitous mechanism of RNA recognition by RRMs.

The PhD candidate will apply methodologies such as regular molecular biology and biochemistry methods for protein/RNA preparation and characterization. She/he will also be involved in biophysical analysis of these samples via a large range of relevant, available and adapted techniques such as X-ray diffraction, BLI, MST…
These biophysics aspects will be complemented with cell biology techniques through our collaboration.
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Début de la thèse : 01/10/2025

Contrat doctoral libre

Université de Bordeaux

154 Sciences de la Vie et de la Santé

Idéalement, l'étudiant/e devra avoir une base dans les spécialités suivantes: biologie moléculaire, biochimie, biophysique et bioinformatique.
Ideally, the student should have a good background in the following specialties: Molecular biology, biochemistry, biophysics and bioinformatics.