Développement de G-quadruplexes chimiquement modifiés et verrouillés à partir de l'oncogène KRAS // Development of chemically modified and locked G-quadruplexes from KRAS

L'oncogène KRAS présente certains des taux de mutation les plus élevés parmi les cellules cancéreuses. Dans sa région promotrice se trouve une séquence unique d'Élément Hypersensible aux Nucléases (NHE), caractérisée par six séries de guanines. Ces séquences riches en guanines ont le potentiel de former des G-quadruplexes (G4), qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes complexes de régulation de l'expression de KRAS. Depuis 2023, après la synthèse et les tests réussis des G4 chimiquement verrouillés comme preuve de concept (PoC), nous avons réalisé des progrès significatifs. Ces études ont établi que les G4 verrouillés peuvent stabiliser des structures secondaires dans des conditions physiologiques, ce qui ouvre la voie à des applications biologiques plus poussées. Nous proposons maintenant de faire évoluer ce projet vers une phase développée intégrant des tests biologiques. Notre objectif principal est de tester ces G4 verrouillés issus de KRAS dans des cellules pancréatiques afin d'évaluer leur capacité à interagir avec des facteurs de régulation clés de KRAS, notamment les protéines MAZ et hnRNP A1. Ces interactions sont essentielles pour comprendre leur potentiel à moduler l'expression de KRAS et à servir de base à de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour 2024, nous prévoyons d'intégrer un élément novateur : un nucléolipide. Ce composant facilitera l'internalisation des G-quadruplexes verrouillés à l'azoture dans les cellules cancéreuses, améliorant ainsi leur biodisponibilité et leur efficacité. Les oligonucléotides à extrémités verrouillées, y compris ceux portant des liaisons à base d'azoture (bis-click), seront synthétisés par la plateforme ARNA de synthèse d'acides nucléiques. Ces modifications chimiques terminales non seulement augmentent la stabilité des structures, mais permettent également de piéger efficacement les complexes protéiques (MAZ et hnRNP A1). En outre, nous avons démontré que le groupe azoture confère une stabilisation supplémentaire aux structures G4. Les études de repliement et de dépliement menées jusqu'à présent indiquent que ces G4 peuvent servir d'intermédiaires piégés pour étudier les étapes initiales de la reconnaissance et du dépliement des G4 par des protéines. Ces travaux offrent une opportunité unique de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l'interaction protéine-G4, particulièrement dans le contexte du promoteur de KRAS. Enfin, les oligonucléotides synthétisés seront soumis à des tests avancés. Nous exprimons de manière recombinante des protéines essentielles comme MAZ et hnRNP A1, qui sont impliquées dans la propagation de cancers liés à KRAS, tels que le cancer du pancréas. Ces protéines seront étudiées par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) pour :
1. Évaluer leur reconnaissance du repliement des G4.
2. Tester la robustesse des oligonucléotides portant plusieurs types de liaisons chimiques face au dépliement par ces protéines.
Ces travaux représentent une avancée importante dans l'exploration des G-quadruplexes en tant que cibles potentielles pour des stratégies thérapeutiques innovantes. Ils combinent la chimie des acides nucléiques, des études biophysiques et des approches biologiques pour offrir une compréhension plus approfondie des interactions entre les protéines et les structures secondaires complexes.
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The KRAS oncogene exhibits some of the highest mutation rates among cancer cells. Within its promoter region lies a unique Nuclease Hypersensitive Element (NHE) sequence, characterized by six guanine runs. These guanine-rich sequences have the potential to form G-quadruplexes (G4), which play a crucial role in the complex regulatory mechanisms controlling KRAS expression.

Since 2023, following the successful synthesis and testing of chemically locked G4 structures as a proof of concept (PoC), significant progress has been made. These studies have demonstrated that locked G4 structures can stabilize secondary structures under physiological conditions, paving the way for more advanced biological applications. We now propose to advance this project into a developed phase that integrates biological testing.

Our primary objective is to test these locked KRAS-derived G4 structures in pancreatic cells to evaluate their ability to interact with key KRAS regulatory factors, particularly the proteins MAZ and hnRNP A1. These interactions are critical for understanding their potential to modulate KRAS expression and serve as a foundation for novel therapeutic strategies.

For 2024, we plan to introduce an innovative element: a nucleolipid. This component will facilitate the internalization of azide-locked G-quadruplexes into cancer cells, thereby enhancing their bioavailability and efficacy.

Locked-end oligonucleotides, including those with azide-based (bis-click) linkages, will be synthesized by the ARNA nucleic acid synthesis platform. These terminal chemical modifications not only increase the structural stability of the G4s but also enable efficient trapping of protein complexes (MAZ and hnRNP A1). Additionally, we have demonstrated that the azide group provides further stabilization to the G4 structures.
Folding and unfolding studies conducted thus far indicate that these G4s can act as trapped intermediates to study the initial stages of G4 recognition and unfolding by proteins. This research offers a unique opportunity to better understand the underlying mechanisms of protein-G4 interactions, particularly in the context of the KRAS promoter.
Finally, the synthesized oligonucleotides will undergo advanced testing. We are recombinantly expressing key proteins such as MAZ and hnRNP A1, which are involved in the spread of KRAS-related cancers, such as pancreatic cancer. These proteins will be studied using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to:
Evaluate their recognition of G4 folding.
Test the robustness of oligonucleotides bearing various chemical linkages against protein-induced unfolding.
This work represents a significant advancement in the exploration of G-quadruplexes as potential targets for innovative therapeutic strategies. By combining nucleic acid chemistry, biophysical studies, and biological approaches, it provides deeper insights into the interactions between proteins and complex secondary structures.
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Début de la thèse : 01/10/2025

Contrat doctoral libre

Université de Bordeaux

154 Sciences de la Vie et de la Santé

étudiant intéressée par l'interface chimie-biologie
Students interested in subjects at the interface between biology and chemistry.