Structure, Dynamique et fonction des RCPG d'adhesion : etude sur molecules uniques // Single molecule studies of adhesion GPCR structure, dynamics, and function

Ce projet combinera des technologies d'extension du code génétique et de marquage bioorthogonal de pointe pour produire des RCPG d'adhésion, dans des cellules de mammifères pour des études structurales par FRET sur molécule unique.
Les cellules communiquent avec leur environnement à travers des récepteurs membranaires qui détectent les stimuli extracellulaires et transmettent des informations à l'intérieur de la cellule, entraînant diverses réponses cellulaires. Les RCPG d'adhésion constituent la deuxième plus grande famille de RCPG, avec 33 membres. Ils jouent un rôle crucial en médiant les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Cette classe particulière de récepteurs est impliquée dans divers processus physiologiques tels que la réparation tissulaire, la réponse immunitaire, le développement neuronal et organique. La dysrégulation des aRCPG a été associée à différentes maladies, notamment les maladies cardiovasculaires, les troubles neurodéveloppementaux, les maladies auto-immunes et la formation des métastases cancéreuses. Alors que des efforts sont en cours pour cibler sélectivement les aRCPG dans le contexte des états pathologiques, notre compréhension de leurs modes d'activation et de régulation est loin derrière celle des RCPG classiques.
Les tentatives de résolution de structures à haute résolution des aRCPG complets n'ont jusqu'à présent fourni que des informations limitées, probablement en raison de leur flexibilité conformationnelle intrinsèque. Cela souligne la nécessité d'approches complémentaires permettant de compléter les structures statiques à haute résolution en considérant la dynamique des récepteurs, pour comprendre comment la liaison des ligands et les forces mécaniques agissent pour réguler de manière allostérique leur signalisation.
À cette fin, la transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) sur molécule unique représente une approche polyvalente car elle permet de mesurer en temps réel les changements conformationnels avec une résolution spatiale sub-nanométrique et une résolution temporelle sub-millisecondes. De plus, la possibilité d'obtenir des informations sur la dynamique structurale de protéines uniques permet de cartographier l'ensemble des états visités par une protéine donnée dans des conditions sélectionnées. Le FRET nécessite la fixation de fluorophores donneurs et accepteurs à la protéine cible. L'utilisation de l'expansion du code génétique pour incorporer des groupements chimiques petits et peu invasifs, sous forme d'acides aminés non canoniques réactifs, offre un grand potentiel pour conserver la fonctionnalité des protéines et étudier la dynamique avec précision et exactitude.
Après extraction et purification, les capteurs FRET seront utilisés pour étudier la dynamique conformationnelle des aRCPG en utilisant un microscope confocal construit sur mesure dans notre équipe.
En stimulant les récepteurs avec des ligands et des forces mécaniques, en utilisant la microscopie à force atomique et des origamis d'ADN, nous caracteriserons le paysage conformationnel de l'activation des aRCPG et quantifieront la dynamique sous-jacente. De cette manière, ce projet fournira des informations mécanistiques d'une importance fondamentale et ouvrira de nouvelles voies pour moduler ces récepteurs dans un contexte pathologique.
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This project will combine state-of-the-art genetic code expansion and biorthogonal labeling technologies to produce adhesion G-Protein Coupled Receptors (GPCR) in mammalian cells for structural studies using single molecule FRET.
Cells communicate with their surrounding through membrane receptors that sense extracellular stimuli and transmit information into the cell's interior, leading to diverse cellular response. Adhesion GPCR (aGPCR) constitute the second largest class of GPCR, comprising 33 unique members. They play a crucial role by mediating cell-cell and cell-matrix interactions. This particular class of receptors is involved in various physiological processes such as tissue repair, immune response, neuronal and organ development. Dysregulation of aGPCRs has been associated with different diseases including for instance cardiovascular diseases, neurodevelopmental disorders, autoimmune diseases and cancer metastasis. While efforts are underway to selectively target aGPCRs within the context of disease states, our understanding of their modes of activation and regulation lack far behind those of classical GPCRs.
Attempts to solve high-resolution structures of full-length aGPCRs have so far only provided limited information, likely due to their inherent conformational flexibility. This highlights the need for complementary approaches that allow to go beyond high-resolution structural snapshots by considering receptor dynamics to understand how ligand binding and mechanical forces act to allosterically regulate aGPCR signaling.
To this end, single molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) represents a versatile approach as it allows to monitor conformational changes in real-time with sub-nanometer spatial and sub-millisecond temporal resolution. In addition, the ability to obtain such structural dynamics information on single molecules overcomes the inherent disadvantage of ensemble and averaging approaches, allowing to map the full repertoire of states visited by a given protein under selected conditions. FRET requires the attachment of donor and acceptor fluorophores to the target protein, which can alter its function. However, the use of genetic code expansion to incorporate small, minimally invasive chemical handles, in the form of reactive non-canonical amino acid building blocks bears great potential to circumvent an impact of labeling on protein functionality and study dynamics with high precision and accuracy.
After extraction and purification, FRET sensors will be used to study the conformational dynamics of aGPCRs at the single molecule level using a unique home-build confocal single molecule microscope. This approach, which is based on pulsed interleaved excitation, allows to access multiple fluorescence parameters to obtain structural information with sub-nanometer precision and temporal information with sub-millisecond resolution, the highest resolution currently possible using smFRET.
Through the stimulation of receptors with ligands and mechanical forces, using atomic force microscopy and DNA origamis, this project will characterize the conformational landscape of aGPCR activation and quantify their underlying dynamics. In this way, it will provide mechanistic insights of fundamental importance and may provide new avenues to modulate such receptors in a pathological context.
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Début de la thèse : 01/10/2025
WEB : https://integrativebiophysicsofmembranes.wordpress.com/robert-quast/

Public funding alone (i.e. government, region, European, international organization research grant)

Concours pour un contrat doctoral

Université de Montpellier

168 Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé

Master or diplome bac+5 equivalent Motivation, curiosité et créativité. Profil d'études dans au moins un des domaines suivants : biochimie, biologie moléculaire, chimie biologique, biophysique. La ou le candidat sera formé.e sur tous les domaines nécéssaires, mais il est attendu un comportement proactif, une bonne autonomie dans l'étude de la bibliographie, ainsi qu'une bonne capacité à résoudre les problèmes. Langues : Capacité à communiquer convenablement en français ou en anglais. Il sera demandé un effort pour améliorer ses capacités de communication dans ces deux langues si nécessaire (via par exemple des cours offerts à l'Université)
Masters or a recognized diploma equivalent to Bac + 5 Highly motivated, curious, and creative student preferably with background in at least one of the following domains: biochemistry, molecular biology, chemical biology and/or biophysics. The student will be trained in all necessary disciplines but is expected to be highly proactive and capable of autonomously performing literature research and demonstrate a good problem-solving capability. Language skills: The candidate should be able to communicate confidently in either English or French and is expected to make an effort to improve his/her communication skills in the other language (e.g. through language classes offered by the University).