Production, purification et cristallographie de 2 domaines récepteurs exprimés en levure

Le laboratoire de Physiologie, Ecologie et Environnement (P2E, ex-LBLGC, EA 1207) concentre ses activités sur deux grands thèmes :

1- La réponse des arbres aux contraintes environnementales, abiotiques et biotiques

2- Les mécanismes d’adaptation des insectes à la plante-hôte

Compte tenu des collaborations et des thèmes développés, une convention a été établie entre l’INRAE et le laboratoire, sous la forme d’une Unité Sous Contrat (USC1328) depuis 2016.

L'équipe dans laquelle s'effectuera le stage s’intitule « Signalisation Cellulaire » et est dirigée par la Dr S. Carpin. Cette équipe concentre ses travaux sur la voie de signalisation sécheresse chez le peuplier. Les études moléculaires réalisées ont permis d'identifier les partenaires de cette voie de signalisation qui participent à la perception et la transduction du signal généré par la contrainte.

Les programmes de recherche du laboratoire s’intègrent dans la politique régionale de développement, en particulier dans le cadre des pôles de compétitivité Cosmetic Valley, DREAM Eaux & Milieux et Végépolys Valley et du cluster de recherche RésoNat.

Contexte : Dans le cadre des relations plantes/environnement, notre équipe s'intéresse aux évènements précoces de la réponse moléculaire du peuplier à un stress hydrique de type sécheresse. Notre étude se focalise sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la perception de la contrainte hydrique, correspondant à une contrainte osmotique au niveau cellulaire, et la transduction de ce signal jusqu'à l'activation de gènes cibles permettant à la plante de répondre à cette contrainte. L'intégration du signal est réalisée par une voie de signalisation de type phosphorelais multiple (MSP), apparentée au système à 2 composantes des bactéries. Nous avons mis en évidence l'existence d'un tel système chez le peuplier, organisme modèle des plantes ligneuses, comprenant 2 récepteurs membranaires (HK1a et HK1b), 10 protéines relais (HPt1 à 10) et une vingtaine de régulateurs de réponse (RR). La perception est réalisée par les récepteurs HK1a et HK1b grâce à un domaine extracellulaire (ECD) exposé entre la membrane et la paroi de la cellule. Au sein de cet ECD se trouve un domaine fonctionnel appelé Cache, connu chez les procaryotes pour fixer de petits ligands. Dans le but de mieux caractériser ce domaine et d’essayer d’identifier le ligand potentiel, une étude biochimique et structurale a été initiée afin de produire, purifier et résoudre la structure 3D de ce domaine par cristallographie. La détermination de la structure tridimensionnelle d’un tel domaine constituerait une première chez les plantes et permettrait de guider l’identification du ligand potentiel.

Objectif : La production de protéine soluble en levure ainsi que la purification ont déjà été réalisées à l’échelle expérimentale pour un récepteur. Il s’agira donc de tester le second récepteur et de continuer le travail avec le premier pour la production en masse, la purification sur colonne d’affinité, puis la réalisation d’essais de cristallisation et, si possible, la cristallographie.

Techniques : Production de protéines recombinantes en bactérie, purification sur colonne de Ni²⁺, SDS-PAGE, Western blot, test de cristallisation (kit), cristallographie par rayons X (Synchrotron Soleil, Saclay).

Expérience et formation souhaitées du candidat :

Le ou la candidat(e) devra posséder de bonnes connaissances en biochime des protéines et avoir un intérêt avéré pour la structure des protéines. L'autonomie, la rigueur et la capacité d'investissement personnel seront les qualités essentielles recherchées.

Un plus si connaissances en biologie végétale.