Recherche de peptides biomarqueurs de l’arthrose dans le liquide synovial

L’Institut de Chimie Physique (ICP) est une unité mixte de recherche interdisciplinaire ancrée en Chimie, avec des projets aux interfaces avec la Physique et les Sciences du Vivant. L’Unité est structurée autour de quatre groupes scientifiques (CAPRI, CpSysBio, TEMiC, TheoSim).

Le stagiaire sera accueilli au sein de l'équipe CAPRI/LETIAM, plus particulièrement spécialisée dans l'analyse des mélanges complexes biologiques, par le couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse. Ce travail s'effectuera en collaboration avec l'hôpital Cochin de Paris.

L’arthrose est une maladie articulaire dégénérative répandue, affectant 10-20 % de la population de plus de 50 ans. Elle est caractérisée par une altération de la structure entière de l’articulation, comprenant entre autres une dégradation progressive du cartilage ainsi qu’une inflammation de la membrane synoviale. A ce jour, il n’existe pas de traitement de l’arthrose si ce n’est le recours aux analgésiques. Afin de pouvoir mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie et de proposer une thérapie, il est primordial de rechercher des biomarqueurs sensibles et spécifiques permettant son diagnostic précoce ainsi qu’un suivi de sa progression avec le temps, en particulier chez les personnes prédisposées (sportifs, diabétiques,…).

Une des caractéristiques de cette maladie est l’apparition dans le liquide synovial présent au niveau de l’articulation malade, de peptides issus de l’hydrolyse de protéines, dont le collagène de type II constituant principal du cartilage (Kamphorst et al. 2007). Nombre de ces peptides sont utilisés en tant que biomarqueurs de la maladie, selon la classification BIPED (« Burden of Disease, Investigative, Prognostic, Efficacy of Intervention and Diagnostic ») (Bauer et al. 2006), mais ils sont tous détectés par immuno-analyse nécessitant la disponibilité d’un anticorps qui sera spécifique à un épitope donné. Or la molécule de collagène de type II est une protéine hautement modifiée (hydroxylée et glycosylée). De plus, les peptides sont formés après action de multiples enzymes dont des métalloprotéases particulièrement actives au niveau de l’articulation arthrosique. Ainsi, nous avons déjà identifié par analyse protéomique non ciblée que l’épitope GPPGPQG utilisé pour le dosage ELISA du biomarqueur du rétrécissement de l’espace articulaire, le TIINE (Hellio Le Graverand et al. 2006) était inclus dans les séquences plus ou moins longues de peptides différents qui sont plus ou moins hydroxylés et glycosylés. Nous proposons donc à l’étudiant (e) qui choisira ce stage de développer une méthode de traitement de l’échantillon utilisant diverses enzymes (hyaluronidase, glycosylase, trypsine, …), qui permettra la simplification de la détection des peptides par chromatographie ulltra haute performance couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (UHPLC-HRMS). Ce projet de stage constitue la première partie d’un travail qui s’inscrit dans un contexte plus large d’identification et de quantification absolue, dans des échantillons biologiques,  des peptides et des peptides présentant des PTM (physiologiques ou pathologiques), issus du collagène de type II.

Plusieurs approches pourront être envisagées. D’une part, une digestion in-silico moyennant des outils bioinformatiques sera effectuée afin de prédire les séquences peptidiques et aider ainsi le processus d’identification in vitro du peptidome. D’autre part, une digestion in vitro moyennant des enzymes telles que la collagénase-3 pour hydrolyser les liaisons peptidiques du collagène II, la hyaluronidase (hydrolyse de l’acide hyaluronique, constituant majeur du liquide synovial), la glucosidase (déglycosylation des peptides) et la trypsine (peptides trypsiques), sera effectuée afin de mettre au point une méthode d’extraction de ces peptides avant analyse UHPLC-HRMS pour identification.

Kamphorst, J. J., van der Heijden R., DeGroot J., Lafeber F. P. J. G., Reijmers T. H., van El B., Tjaden U. R., van der Greef J., and Hankemeier T. 2007. “Profiling of Endogenous Peptides in Human Synovial Fluid by NanoLC-MS: Method Validation and Peptide Identification.” Journal of Proteome Research 6 (11): 4388–96.

Bauer A.D.C, Hunter D.J., Abramson S.B., Attur M., Corr M., Felson D., Heinegård D., Jordan J.M., Kepler T.B.,  Lane N.E., Saxne T., Tyree B., Kraus V.B.2006. Review Classification of osteoarthritis biomarkers: a proposed approach1. Osteoarthritis and Cartilage 14 (8): 723-727.

Hellio Le Graverand,M.P., Brandt K.D., Mazzuca S.A., Katz B.P., Buck R., Lane K.A., Pickering E., Nemirovskiy O.V., Sunyer T.,  Welsch D.J. 2006. Association between concentrations of urinary type II collagen neoepitope (uTIINE) and joint space narrowing in patients with knee osteoarthritis.  OsteoArthritis and Cartilage 14: 1189e1195.

L’étudiant (e) , biochimiste ou chimiste ayant des connaissances sur les biomolécules, intéressé(e) par le projet devra avoir une connaissance théorique des couplages de la chromatographie avec la spectrométrie de masse dans un contexte d’analyse protéomique. Un stage ou une expérience pratique en analyse protéomique sera un plus.