Etude de l’effet de cannabinoïdes endogènes et exogènes sur le microenvironnement lipidique des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 au niveau plaquettaire

1 Positionnement du projet et contexte scientifique

Ce projet de thèse fait partie du travail initié par les équipes SINERGIES et Chrono-Environnement autour de la détermination de la composition lipidique des membranes plasmatiques des plaquettes, la modélisation numérique de celles-ci et l’étude de composés membranotropes. Depuis son lancement, ce projet a permis la soutenance de 4 thèses de doctorat et la valorisation par la publication d’une quinzaine d’articles. Pour aller plus loin dans la compréhension du microenvironnement lipidique des récepteurs, nous souhaitons conforter ces liens et développer une collaboration avec l'Institut de chimie et biologie des membranes et nano-objets (CBMN) de Bordeaux. Ce travail a déjà débuté grâce aux données préliminaires recueillies par l’équipe du Dr Isabel Alves (médaille de bronze du CNRS) qui est une experte de la mesure du microenvironnement lipidique des membranes et des récepteurs cannabinoïdes en France.

Jusqu’à présent et dans le cadre de nos travaux, nous nous sommes intéressés aux récepteurs P2Y12 et leur microenvironnement lipidique. Dans ce travail, nous souhaitons étendre nos recherches aux récepteurs cannabinoïdes. En effet, le système endocannabinoïde participe à la régulation de l’homéostasie générale de l’organisme et à divers mécanismes physiopathologiques, notamment les maladies cardiovasculaires [1,2]. Ainsi, ce système endocannabinoïde constitue une cible de choix pour de nouveaux candidats médicament. Deux récepteurs cannabinoïdes, CB1 et CB2, appartenant à la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) ont été identifiés comme cible chez l’Homme. Ces récepteurs CB1 et CB2 sont retrouvés au niveau central et exprimés également sur d’autres types cellulaires telles que les plaquettes [3]. Les antagonistes CB1 et les agonistes CB2 sont des traitements qui semblent prometteurs dans la prévention et le traitement des maladies cardiovasculaires [4–6] mais leur développement clinique reste encore limité en raison de leur profil d’effets indésirables, lié en partie au fait que ces récepteurs sont ubiquitaires.

La modulation spécifique du système endocannabinoïde au niveau des plaquettes a été  envisagée pour réguler les phénomènes d’athérosclérose et de thromboses artérielles [7]. En effet, la fonction plaquettaire peut être modulée par les endocannabinoïdes circulants ou produit par l’endothélium lui-même [8,9]. L’endothélium est source de synthèse des endocannabinoïdes, mais également un site de métabolisme [10]. Par conséquent, l'équilibre entre la libération d'endocannabinoïdes et leur métabolisme dépendant de l'endothélium est un élément clé dans la formation des thromboses, avec parfois un équilibre modifié dans les états pathologiques, notamment dans l'athérosclérose. Les plaquettes contiennent, à l’instar de l’endothélium, des précurseurs lipidiques permettant la synthèse d’endocannabinoïdes.

Deux endocannabinoïdes impliqués dans le fonctionnement des plaquettes, le 2-Arachidonylglycérol (2-AG) et l’anadamide, ont été identifiés. En effet, les plaquettes activées par la thrombine libèrent du 2-AG [11,12] qui a la capacité de se lier avec le récepteur cannabinoïde (Ki=15 mM), bien que cette activité soit plus faible que celle de l'anandamide [11]. Plusieurs études antérieures ont rapporté des résultats controversés concernant l'effet des cannabinoïdes sur l'agrégation et la survie des plaquettes [13–19] avec un effet parfois indépendant de l’activation des récepteurs CB1 et/ou CB2.

Par ailleurs, Di Scala et al. [20] a montré que l’anandamide a la capacité de s’insérer dans la membrane plasmique avec une sélectivité pour le cholestérol et les céramides. Le cholestérol assure l'insertion membranaire de l'anandamide et son transport vers les récepteurs CB1 pour atteindre la voie classique de transduction du signal et/ou vers les protéines intracellulaires pour atteindre la voie de l'hydrolyse. Cette observation rejoint nos travaux sur les antiagrégants plaquettaires et en particulier avec le ticagrélor. Récemment, nous avons mis en évidence les propriétés membranotrope du ticagrélor, qui en s’insérant dans la membrane des plaquettes modifie le micro-environnement lipidique autour des récepteurs cibles P2Y12. Ce remaniement du micro-environnement lipidique participe au changement conformationnel des récepteurs P2Y12 et favorise ainsi la liaison de ces derniers au ticagrélor [21].  

Afin de mieux comprendre les interactions entre des endocannabinoïdes et des cannabinoïdes candidats médicaments et les plaquettes, nous souhaitons 1) évaluer l’effet de ces ligands sur le microenvironnement lipidique membranaire plasmatique des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 des plaquettes, 2) étudier l’impact sur la dynamique, la conformation et la fonctionnalité de ces récepteurs CB1 et CB2 vis-à-vis de ces ligands.

Cette approche permettrait à l’avenir d’améliorer le design des pharmacophores des nouveaux candidats médicaments en optimisant la fonctionnalité via l’interaction membranaire et en optimisant la spécificité cellulaire, ici les plaquettes.

2 Etapes du projet

a) bibliographique et d’identification des endocannabinoïdes exogènes d’intérêts

Il s’agira de faire un état de l’art bibliographique des ligands endogènes et des ligands exogènes agonistes, antagoniste, agoniste inverse des récepteurs CB1 et CB2 pour préciser ceux qui ont un potentiel usage thérapeutique dans l’athérosclérose et les thromboses artérielles. Cet état de l’art pourra s’appuyer sur des méthodes de machine learning de recherche bibliographique développées par l’équipe de Chrono-Environnement.

b) Etape d’étude des ligands endogènes et de candidats médicament des récepteurs CB

• Expérimentations in silico (UMR Chronoenvironnement) :

Il s’agira de modéliser les récepteurs CB1 et CB2 intégrés dans la membrane plasmique plaquettaire. Cela s’appuie sur nos précédents travaux qui ont permis d’élaborer un modèle de membrane plasmique plaquettaire numérique spécifique, ainsi que sur la description de la structure cristallisée des récepteurs CB1 et CB2 décrites dans la littérature. L’insertion des différents ligands d’intérêts identifiés dans l’étape précédente sera évaluée, ainsi que l’impact sur le microenvironnement membranaire (réorganisation des lipides, paramètres d’ordre, niveau d’énergie, dynamique des lipides…) et sur les récepteurs eux-mêmes (positionnement, conformation, oligomérisation)

• Expérimentations in vitro :
  • D’une part avec une évaluatin des effets au niveau moléculaire (CBMN) :

Des techniques impliquant des modèles de Large Unilamellar Vesicles (LUVs) incubées en l’absence ou en présence des ligands identifiés préalablement à différentes concentrations, d’utilisation de spectroscopie à résonance plasmonique (PWR), de microscopie et de spectroscopie de fluorescence permettront d’évaluer la variation de la fluidité membranaire, l’évolution des transitions de phases des lipides, et les changements structurels et dynamiques de la membrane lors de l'interaction entre des ligands et des récepteurs couplés aux protéines G, afin de mieux caractériser l’interaction des ligands d’intérêts que nous aurons identifiés.

• • D’autre part avec une évaluatin des effets au niveau cellulaire (UR SINERGIES) :

Les phénomènes d’oligomérisation des récepteurs CB au niveau des plaquettes avant ou après incubation avec les ligands identifiés seront évalués, via des techniques SDS-Page non réducteur suivi d’un Western Blot en cas de liaison non covalente entre les dimères voire d’un Cross-link chimique suivi d’un Western Blot en cas de liaison non covalente entre les dimères.

Pour finir, l’effet fonctionnel des endocannabinoïdes et des ligands candidat médicament sur les plaquettes humaines sera évalué in vitro via des tests d’agrégation plaquettaires.

Une étude complémentaire après incubation des plaquettes avec ou sans ligand en présence de cultures de cellules endothéliales qui coopèrent étroitement avec les plaquettes est également envisagée.

Université Marie et Louis Pasteur

Laboratoire d'accueil : SINERGIES

Connaissances et compétences requises :

Le doctorant recruté devra avoir des compétences solides en calcul numérique à l’échelle moléculaire. Il devra pouvoir appréhender les mécanismes biophysiques, chimiques et des aspects de de pharmacologie.