Heme enhances TNF-α-mediated activation of the NLRP3 inflammasome in cardiomyocytes

Cardiovascular diseases are currently the leading cause of death worldwide. These diseases are associated with a pro-inflammatory environment characterized by elevated secretion of cytokines, such as TNF-α, and the production of Damage Associated Molecules Patterns (DAMPs) such as ROS. These factors promote an exacerbation of cardiac inflammation leading to cardiac damage and one of the main players in this process is an inflammatory complex known as NLRP3 inflammasome. This intracellular protein complex is involved in innate immunity and its activation leads to the secretion of specific cytokines (IL-1b and IL-18) usually linked to a type of cell death called pyroptosis. While this mechanism is well-described in key immune cells such as macrophages, its activation in cardiomyocytes remains poorly defined. Our recent unpublished studies have shown that mice with cardiovascular damage induced by ischemia-reperfusion, exhibit a marked increase in cardiac TNF-α and IL-1b levels in association with and elevated heme in circulation. This free heme might come from the degradation of heme-rich proteins from mitochondria and myoglobin in cardiomyocytes and participate in the inflammatory process in the myocardium post-injury. Furthermore, we performed  in vitro studies using human cardiomyocyte cell lines, clearly showing that TNF-α, in combination with heme, induces synergistic activation of the NLRP3 inflammasome. Thus, our results suggest that heme could be considered as a potent DAMP, as it exerts pro-oxidant and pro-inflammatory activities. The main goal of this thesis is to investigate how heme promotes the overactivation of TNF-α-mediated NLRP3 inflammasome in cardiomyocytes. We will develop the project in three main aims:

The first aim will determine how heme induces an exacerbation of TNF-α-induced NLRP3 activation in cardiomyocytes in vitro. We will use immortalized cardiomyocyte cell lines treated with TNF-α in the presence or absence of heme. Biochemical and molecular analyses will be used to assess NLRP3 activation. The signaling pathways, cellular toxicity (including a comprehensive assessment of cell death and oxidative stress), and heme metabolism (heme/myoglobin content and degradation) will be investigated. Experiments in the presence of a heme scavenger will allow us to define the role heme in the activation of NLRP3.

In the second aim, we will use hiPSC-CMs (cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells) treated under similar conditions to those described in the first objective. A precise analysis of cardiac function will be conducted by monitoring contractility, calcium metabolism, and mitochondrial function (Seahorse, ATP). To establish a direct link between the observed cardiac dysfunctions and the specific activation of NLRP3, studies will also be carried out in the presence of a selective NLRP3 inhibitor.

Finally, in the third aim we will use mice models featuring an excess of circulating heme. Cardiac inflammation will be assessed (NLRP3 activation, levels of pro-inflammatory cytokines, IL-6, IL-8, in cardiac tissue and circulation). Oxidative stress and metabolism will also be evaluated. Finally, cardiac alterations will be thoroughly analyzed through various biochemical and imaging experiments.

In summary, this PhD project aims to characterize the role of heme in the regulation of NLRP3 activation during cardiac inflammation.

Les maladies cardiovasculaires constituent actuellement la première cause de mortalité dans le monde. Ces maladies sont associées à un environnement pro-inflammatoire caractérisé par: une sécrétion accrue de cytokines, telles que le TNF-α, et la production de molécules associées aux lésions (DAMPs), comme les espèces réactives oxygénées (ERO). Ces facteurs favorisent une exacerbation de l'inflammation cardiaque conduisant à des lésions cardiaques. L'un des principaux facteur impliqué dans ce processus est la suractivation d’un complexe inflammatoire connu sous le nom de l’inflammasome NLRP3. Ce complexe protéique intracellulaire intervient dans l'immunité innée et son activation entraîne la sécrétion de cytokines spécifiques (IL-1β et IL-18), généralement associées à un type de mort cellulaire appelé pyroptose. Si ce mécanisme est bien décrit dans des cellules immunitaires clés comme les macrophages, son activation dans les cardiomyocytes reste mal définie. Nos études préliminaires ont montré que les souris présentant des lésions cardiovasculaires induites par une ischémie-reperfusion, montrent une augmentation marquée des taux cardiaques de TNF-α et d'IL-1β, associée à une élévation de l'hème en circulation. Cet hème libre pourrait provenir de la dégradation de protéines riches en hème issues des mitochondries et de la myoglobine dans les cardiomyocytes, et participer au processus inflammatoire dans le myocarde lésé. De plus, nous avons mené des études in vitro à partir de lignées cellulaires de cardiomyocytes humains, qui ont clairement démontré que le TNF-α, en association avec l'hème, induit une activation synergique de l'inflammasome NLRP3. Ainsi, nos résultats suggèrent que l'hème pourrait être considéré comme un puissant DAMP, car il exerce des activités pro-oxydantes et pro-inflammatoires. L'objectif principal de cette thèse est d'étudier comment l'hème favorise la suractivation de l'inflammasome NLRP3 médiée par le TNF-α dans les cardiomyocytes. Nous développerons ce projet autour de trois axes principaux:

Le premier objectif consistera à déterminer comment l'hème induit une exacerbation de l'activation de NLRP3 provoquée par le TNF-α dans les cardiomyocytes in vitro. Nous utiliserons des lignées cellulaires de cardiomyocytes immortalisées traitées au TNF-α en présence ou non d'hème. Des analyses biochimiques et moléculaires seront mises en œuvre pour étudier cette activation.

Les voies de signalisations, la toxicité cellulaire (y compris une évaluation complète de la mort cellulaire et du stress oxydatif) et le métabolisme de l'hème (teneur en hème/myoglobine et dégradation) seront étudiés. Des expériences en présence d'une protéine séquestrice de l’hème nous permettront de définir le rôle de l'hème dans l'activation de NLRP3.

Dans le cadre du deuxième objectif, nous utiliserons des hiPSC-CM (cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines) traités dans des conditions similaires à celles décrites dans le premier objectif. Une analyse précise de la fonction cardiaque sera réalisée en surveillant la contractilité, le métabolisme calcique et la fonction mitochondriale (Seahorse, ATP). Afin d'établir un lien direct entre les dysfonctionnements cardiaques observés et l'activation spécifique de NLRP3, des études seront également menées en présence d'un inhibiteur sélectif de NLRP3.

Enfin, dans le troisième objectif, nous utiliserons des modèles murins présentant un excès d'hème circulant. L'inflammation cardiaque sera évaluée (activation de NLRP3, taux de cytokines pro-inflammatoires, IL-6 et IL-8, dans le tissu cardiaque et la circulation sanguine). Le stress oxydatif et le métabolisme feront également l'objet d'une analyse. Enfin, les altérations cardiaques seront etudiées de manière approfondie à l'aide de diverses techniques biochimiques et d'imagerie.

En résumé, ce projet de doctorat vise à caractériser le rôle de l'hème dans la régulation de l'activation de NLRP3 lors de l'inflammation cardiaque.

The Mondor Institute for Biomedical Research (IMRB, U955 Inserm – Université Paris Est Créteil, UPEC) is one of the main biomedical research centres in the eastern part of the Paris region with national and international influence. The research teams develop high-level translational research in a wide variety of fields in direct connection with healthcare services and a large number of patient cohorts. The laboratory of the group of Motterlini-Foresti is internationally recognized in the field of vascular biology and drug discovery. The team has a long-standing interest in the regulation, activity and biological significance of heme oxygenase-1 (HO-1), a ubiquitous defensive protein that degrades heme to carbon monoxide (CO) and biliverdin. The study are focused on understanding : -the physiological role of CO and bile pigments in cardiovascular biology as well as their protective action against stressful stimuli and obesity. -  Heme as a danger molecule in heart damage (inflammation, iron metabolism, ROS signaling).

We are currently seeking highly motivated young scientists interested in pursuing a PhD in biological sciences. Potential candidates will possess skills in cell culture, biochemistry and molecular biology assays. A comprehensive understanding of general inflammation and cardiovascular physiology is also required. Knowledge with the culture of hiPSC and in vivo experimentation is highly recommended.

Nous recherchons actuellement de jeunes candidats très motivés souhaitant préparer un doctorat en sciences biologiques. Les potentiels candidats devront posséder des compétences en culture cellulaire, en biochimie et en techniques de biologie moléculaire. Une compréhension approfondie de l'inflammation et de la physiologie cardiovasculaire est également requise. Une expérience de la culture de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) et de l'expérimentation in vivo est fortement recommandée.