Identification et caractérisation fonctionnelle de protéines S-nitrosées végétales et fongiques impliquées dans la symbiose mycorhizienne à arbuscules

Contexte de l’étude

Chez les plantes, des travaux initiés à la fin des années 1990 ont mis en évidence le rôle clé du monoxyde d’azote (NO) dans des processus physiologiques variés tels que la croissance des racines, la fermeture des stomates, la floraison, le contrôle de la synthèse de phytohormones et la réponse aux stress. Notre équipe a notamment contribué à démontrer l’importance du NO dans la réponse immunitaire des plantes aux microorganismes pathogènes (Berger et al., 2025 ; Jeandroz et al., 2016 ; Nicolas-Francès et al., 2022). Le NO joue également un rôle clé dans les interactions entre les plantes et les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), qui établissent avec les plantes une symbiose mutualiste essentielle à leur croissance et à leur adaptation aux stress environnementaux abiotiques et biotiques. Cette symbiose est étudiée depuis longtemps au laboratoire, notamment pour son rôle dans la nutrition et la santé des plantes (Noceto et al., 2021 ; Sportès et al., 2021 ; Wipf et al., 2019). Or, cette symbiose repose sur un dialogue moléculaire complexe, où le NO joue un rôle central, tant dans l’initiation que dans le maintien de l’association bénéfique (Martínez-Medina et al., 2019a).

En effet, dès les premières minutes suivant l’exposition aux exsudats fongiques, les racines végétales réagissent par une production rapide de NO, principalement via l’activité de la nitrate réductase (NR). Cette production a été montrée chez des plantes de Medicago truncatula inoculées par les CMA Gigaspora margarita (Calcagno et al., 2012), Rhizoglomus irregularis (Martínez-Medina et al., 2019b) ou Trifolium repens (Zhang et al., 2013).  L’inhibition de la production ou le piégeage du NO bloquent d’ailleurs la colonisation fongique, confirmant le rôle indispensable du NO dans la phase pré-symbiotique (Calcagno et al., 2012).

Au-delà de la phase précoce, le NO continue de jouer un rôle clé pendant la colonisation des racines. Par exemple, des travaux réalisés sur Citrus trifoliata ont révélé que des niveaux soutenus de NO, 21 jours après l’inoculation avec Diversispora versiformis, contribuent à la pérennité de la symbiose (Zou et al., 2017). Le NO pourrait être impliqué dans le contrôle de plusieurs processus tels que le remodelage de la paroi cellulaire, le développement des racines latérales et la modulation de la défense de l'hôte (Fiorilli et al., 2024).

Le NO s’impose donc comme un acteur clé pour l’établissement et le fonctionnement de la symbiose mycorhizienne à arbuscules en agissant à la fois comme un signal précoce et comme un régulateur à long terme. Néanmoins, son mécanisme d’action reste encore très peu connu.

Objectif de la thèse

L’objectif du projet de thèse proposé est d’identifier, puis de caractériser d’un point de vue fonctionnel, des protéines végétales ou fongiques régulées au niveau post-traductionnel par le NO. Plus précisément, nous nous intéresserons à la S-nitrosation (ou S-nitrosylation). Dans ce processus, le NO établit de façon réversible une liaison covalente avec l’atome de soufre de résidus cystéine réduits. Ce mécanisme est induit par des agents nitrosants tels que le nitrosoglutathion (GSNO) ou l’ion nitrosonium (NO⁺), ou par des protéines S-nitrosées transférant le groupe NO sur une protéine cible (Chaudron et al., 2025). La S-nitrosation impacte les protéines de différentes façons : activation ou inhibition de leur activité, translocation dans d’autres compartiments cellulaires, association ou dissociation de complexes protéiques par exemple. L’identification de protéines S-nitrosées puis leur caractérisation permettra d’étudier de façon fine le rôle fonctionnel du NO dans les interactions plantes-CMA. Nous souhaitons travailler dans ce projet sur la symbiose entre la plante modèle Medicago truncatula et le champignon modèle Rhizophagus irregularis. En effet, l’équipe maîtrise parfaitement le système de culture et a récemment montré que l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) est essentielle à l'établissement et au fonctionnement de la symbiose mycorhizienne à arbuscules en modulant l'ubiquitination des protéines (Inès et al., 2025). La thèse demandée assurera le continuum de ces travaux.

Organisation de la thèse et démarche expérimentale : La thèse sera organisée en trois axes.

Axe 1 : Identification de protéines S-nitrosées dans les interactions plantes-CMA

Après établissement de la symbiose mycorhizienne, les tissus végétaux (racines colonisées ou non d’une part et tissus aériens d’autre part) seront récupérés et congelés dans l’azote liquide à des temps courts (quelques heures) ou plus tardifs (plusieurs jours). Les protéines totales seront extraites et parmi celles-ci, les protéines S-nitrosées seront purifiées par la méthode du Biotin-Switch consistant à convertir la liaison NO-Cys en liaison biotine-Cys puis à enrichir celles-ci par affinité sur billes de streptavidine. Le système de culture et la technique du Biotin-Switch sont parfaitement maîtrisés par l’équipe. Les protéines recueillies seront identifiées par spectrométrie de masse par la plateforme de protéomique de Toulouse (ProtéoToul).

Axe 2 : Analyse du rôle du NO sur la structure/fonction des protéines cibles

L’axe 1 permettra d’identifier des protéines potentiellement S-nitrosées. Seules les protéines identifiées dans 3 expériences biologiques indépendantes seront présélectionnées. Pour la suite des expériences et sur la base de notre expertise actuelle, nous sélectionnerons au maximum 3 protéines. Nous nous attacherons à préférentiellement sélectionner des protéines pour lesquelles le(s) résidu(s) cystéine identifié(s) joue(nt) potentiellement un rôle catalytique ou structural. Outre une étude bibliographique, des approches de modélisation structurale in silico devraient aiguiller cette sélection.

Une fois sélectionnées, les protéines seront produites en système hétérologue et leur S-nitrosation sera étudiée in vitro. Il s’agira d’étudier l’impact du NO sur leur activité (si mesurable) et leur structure (en particulier par dichroïsme circulaire et analyse de l’émission de fluorescence des résidus tryptophane). En parallèle, le ou les résidus S-nitrosés seront identifiés par mutagénèse dirigée et spectrométrie de masse quantitative.

Axe 3 : Etude de l’incidence de la S-nitrosation in vivo

L’axe 2 permettra de comprendre l’incidence de la S-nitrosation sur la fonction et la structure des protéines d’intérêt. L’axe 3 étendra cette analyse in vivo. Nous utiliserons des méthodes de transformation de l’hôte végétal afin de pouvoir développer des approches de surexpression ou d’invalidation de l’expression de gènes d’intérêt (approche CRISPR/CAS9 notamment, Lawrenson et al., 2023).

Pour chaque protéine sélectionnée dans l’axe 2, l’objectif sera d’obtenir une lignée de plante invalidée dans l’expression du gène correspondant. Sur ce fond génétique, nous sur-exprimerons ensuite soit la protéine sauvage, soit la protéine mutée sur le/les résidu(s) Cys régulés par S-nitrosation. L’efficacité de la mycorhization sera ensuite étudiée de même que l’effet de la S-nitrosation de la protéine d’intérêt.

Université de Bourgogne Europe

Laboratoire d'accueil : AGROECOLOGIE

- connaissances et compétences requises

Les étudiants intéressés par le projet devront posséder des compétences en biochimie des protéines, en biologie cellulaire et moléculaire, en signalisation cellulaire et en physiologie végétale.