Biofabrication de la prochaine génération de modèles de disques intervertébraux complets

Le disque intervertébral (DIV) est composé d’un anneau externe de fibres de collagène (AF), d’un noyau gélatineux (NP) et des plateaux cartilagineux (CEP) à l’interface avec les vertèbres, permettant la diffusion des nutriments vers le DIV avasculaire. La dégénérescence du DIV est associée à la lombalgie, qui touche plus de 80 % des adultes au cours de leur vie et entraîne une incapacité et des conséquences socio-économiques considérables.

Les patients qui ont épuisé les traitements conservateurs (médicaments contre la douleur et physiothérapie) n'ont plus d'autre choix qu'une intervention chirurgicale invasive et coûteuse. Les stratégies de régénération d'inspiration biologique ont récemment fait l'objet d'une attention accrue et des modèles animaux précliniques ont été mis en place pour évaluer leur efficacité. Cependant, les directives éthiques et les préoccupations relatives au bien-être animal ont conduit au principe des trois R (Remplacer, Reduire, Rafiiner), et des alternatives à l'expérimentation animale sont nécessaires.

Les cultures conventionnelles en monocouche de cellules ne parviennent pas à récapituler la structure 3D complexe du DIV et ne peuvent pas refléter avec précision la réponse in vivo. Des modèles précliniques en 3D sont donc nécessaires. Nous avons déjà conçu un modèle partiel d'un DIV sain qui reproduit l'organisation spatiale du Nucleus Pulposus (NP) et partiellement celui de l’Annulus Fibrosus (AF).

Le but de ce projet doctoral est de poursuivre le développement de ce modèle tridimensionnel de disque intervertébral en y associant le 3ème compartiment (CEP) et en améliorant les propriétés physiques et mécaniques de l’AF. Pour cela, une stratégie basée sur la biofabrication à partir d’encres composés de polymères naturels sera adoptée. Ce modèle sera ensuite utilisé pour étudié la dégénérescence par l’ajout des composants biologiques et biomécaniques de la pathologie.

La première partie de ce projet sera dédiée au développement des bioencres (biopolymères + cellules) qui seront utilisées pour mimer l’Annulus Fibrosus (AF) et les plateaux cartilagineux (CEP) et ceci en utilisant l’impression 3D. Pour ce faire, nous allons procéder à une étude systématique afin de générer des hydrogels cellularisés à base de collagène avec des propriétés mécaniques, physiques et biochimiques modulables. Ces formulations devront être compatibles avec la survie de cellules tels que les fibroblastes et les cellules mésenchymateuses. Nous allons tout d’abord augmenter la concentration de collagène pour savoir quelle est celle qui permet une bonne survie cellulaire, une morphologie adéquate et une bonne stabilité des hydrogels (absence de contraction). Ensuite, nous y associerons l’acide hyaluronique afin d’augmenter les capacités d’hydratation des différentes bioencres et de se rapprocher des propriétés biochimiques du disque intervertébral. Les hydrogels seront caractérisés par des techniques de rhéologie, microscopie électronique à balayage et Differential Scanning Calorimetry (DSC). La viabilité des cellules sera analysée par Live/dead assay, leur morphologie observée par microscopie confocal après marquage à la Phalloidine.

La deuxième partie de cette thèse sera consacrée à la synthèse des différents biomatériaux mimant le CEP et l’AF à partir des bioencres sélectionnés. LE CEP est un tissu d’une épaisseur de 1 mm qui possède une partie non minéralisée (au contact de l’AF) et une partie minéralisée (au contact de l’os sous chondrale). La stratégie utilisée sera d’imprimer une couche de collagène dense cellularisée pour atteindre une rigidité de 10 kPa et une autre similaire mais associée à des nanoparticules d’hydroxyapatite. Les conditions d’impression devront moduler la porosité des biomatériaux. Un matériau poreux reproduira les caractéristiques d’un CEP physiologique et un CEP peu poreux mimera les conditions pathologiques de la dégénérescence du DIV. Les propriétés mécaniques de ces construits seront analysées par traction mécanique et leur structure par microscopie à balayage. Les cellules encapsulées seront des cellules mésenchymateuses qui seront in situ différenciées en chondrocyte-like cells par le TGF-Beta et le GDF-5. Le phénotype de ces cellules sera étudié par Q-PCR, microscopie confocal et cytométrie de flux. Les marqueurs chondrocytaires tels que le collagène II, l’aggrécan et le collagène 10 seront recherchés en premier lieu.

Afin de mimer l’Annulus Fibrosus, une structure élastique, déformable et anisotrope développées par nos collaborateurs à RMeS Nantes et générée par melt electrowriting sera utilisée. La bioencre utilisée dans ce cas sera cellularisée par des fibroblastes ou des cellules AF. La teneur en polysaccharides devra être optimale,  le construit devra être stable et permettre l’étalement des fibroblastes sur la structure. Le phénotype des cellules sera également étudié par PCR quantitative et microscopie confocale.

La dernière partie de ce projet aura pour but d’assembler les biomatériaux mimant les différentes parties du disque intervertébral et d’obtenir un modèle cohésif prêt à être utilisé pour étudier la dégénérescence du disque intervertébral. Les différents biomatériaux développés lors de ce doctorat seront utilisés pour l'assemblage ainsi que l’hydrogel mimant le Nucleus Pulposus développé par AO Foundation.

Ce projet est un projet bilatéral entre la France et la Suisse financé par l’agence national de la recherche. Il comprend le laboratoire RMeS de l’université de Nantes (France), le LCMCP (France) et AO Fondation à Davos (Suisse).

L'équipe « Matériaux et Biologie » du Laboratoire de Chimie de la Matière Condensée (LCMCP) rassemble des chimistes, biologistes et physiciens autour de thématiques visant à développer des matériaux « vivants », en nous appuyant sur une meilleure compréhension des interactions cellules-matériaux. 

Nos champs d’application dans le domaine biomédical s’appuient sur la mise en commun de ces champs d’expertise  et sur un large réseau de collaborations nationales et internationales pluridisciplinaires. Citons en particulier: 

– Cornées artificielles biomimétiques
– Biomatériaux mixtes et nanocomposites à base de collagène pour la réparation et la régénération tissulaire
– Modèles 3D du disque intervertébral
– Fabrication additive de biomatériaux pour la réparation cardiaque
– Cryo-procédés cytocompatibles pour la bioremédiation et la santé
– Biomatériaux pour la réparation oro-faciale

Nous recherchons un(e) doctorant(e) titulaire d’un Master ou d’un diplôme d’ingénieur en génie biomédical ou en chimie des matériaux, avec de solides bases en biologie cellulaire. Une première expérience en impression 3D de biopolymères serait un atout.