Exploration du rôle du domaine C2 dans l'interaction de la phospholipase D avec la membrane par une approche structurale multi-échelle // Exploration of the role of the C2 domain in the interaction of Phospholipase D with the membrane using a multiscale s

La phospholipase D (PLD) est enzyme interfaciale impliquée dans l'hydrolyse des phospholipides membranaires. Le produit de lipolyse, l'acide phosphatidique est un second messager impliqué dans l'activation de nombreuses voies de signalisation cytosoliques et membranaires. La région N-terminale des isoformes de PLD de plantes contient un domaine C2, qui permettrait une interaction calcium-dépendante avec les membranes et régulant ainsi l'activité catalytique de ces enzymes en présence d'effecteurs tels que certains lipides anioniques, notamment le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2). Le domaine C2 est largement conservé au cours de l'évolution et se retrouve dans de nombreuses protéines eucaryotes, notamment humaines, impliquées dans les processus de signalisation et/ou interagissant avec les phospholipides, telles que la protéine kinase C, la phospholipase A2 cytosolique, la phospholipase C1, la synaptotagmine et certaines protéines du trafic vésiculaire.
Une question centrale demeure cependant ouverte : comment la reconnaissance membranaire par le domaine C2 contrôle-t-elle l'orientation de l'enzyme aux interfaces, l'accessibilité du site actif et l'efficacité catalytique ? Les bases moléculaires du couplage entre l'ancrage membranaire et la catalyse restent largement méconnues. À ce jour, les données structurales disponibles sur les isoformes de PLD sont très limitées. Dans ce contexte, ce projet de thèse vise à utiliser les deux isoformes de PLD d'Arabidopsis thaliana (AtPLDα et AtPLDβ) comme modèles pour explorer les mécanismes universels de reconnaissance membranaire par les domaines C2.
Ces PLD ainsi que chaque domaine C2 isolé seront produits par expression recombinante, purifiés et marqués isotopiquement. Les interactions avec des membranes biomimétiques seront étudiées par RMN afin de caractériser, à l'échelle atomique, l'effet du calcium, du PIP2 et de la composition lipidique sur l'affinité membranaire, la spécificité lipidique et la dynamique conformationnelle. Des approches complémentaires (dichroïsme circulaire, SEC-MALS, films monomoléculaires en cuve de Langmuir) permettront d'analyser la stabilité, l'oligomérisation et les propriétés interfaciales de la PLD et de son domaine C2 isolé. Enfin, une approche intégrative combinant RMN et cryo-microscopie électronique sera développée afin de décrire l'organisation des enzymes complètes à la membrane et les réarrangements structuraux associés à l'activation catalytique.
Au-delà du cas des PLD de plantes, ce travail apportera des connaissances fondamentales sur le fonctionnement des domaines C2 et, plus largement, sur les mécanismes de régulation gouvernant l'interaction des protéines avec les membranes via ce domaine.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Phospholipase D (PLD) is an interfacial enzyme involved in the hydrolysis of membrane phospholipids. The lipolysis product, phosphatidic acid, is a second messenger involved in the activation of numerous cytosolic and membrane signaling pathways. The N-terminal region of plant PLD isoforms contains a C2 domain, which would to mediate a calcium-dependent interaction with membranes, thereby regulating the catalytic activity of these enzymes in the presence of effectors such as certain anionic lipids, particularly phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2). The C2 domain is highly conserved throughout evolution and is found in many eukaryotic proteins, including human proteins involved in signaling processes and/or interacting with phospholipids, such as protein kinase C, cytosolic phospholipase A2, phospholipase Cδ1, synaptotagmin, and certain vesicular trafficking proteins.
However, a central question remains unresolved: how does membrane recognition by the C2 domain control enzyme orientation at interfaces, active-site accessibility, and catalytic efficiency? The molecular basis of the coupling between membrane anchoring and catalysis remains largely unknown. To date, structural data available for PLD isoforms are very limited. In this context, this PhD project aims to use the two PLD isoforms from Arabidopsis thaliana (AtPLDα and AtPLDβ) as models to explore the universal mechanisms of membrane recognition by C2 domains.
These PLDs, as well as each isolated C2 domain, will be produced by recombinant expression, purified, and isotopically labeled. Their interactions with biomimetic membranes will be investigated by NMR in order to characterize, at atomic resolution, the effects of calcium, PIP2, and lipid composition on membrane affinity, lipid specificity, and conformational dynamics. Complementary approaches (circular dichroism, SEC-MALS, Langmuir trough monolayer films) will be used to analyze the stability, oligomerization, and interfacial properties of PLD and its isolated C2 domain. Finally, an integrative approach combining NMR and cryo-electron microscopy will be developed to describe the organization of the full-length enzymes at the membrane and the structural rearrangements associated with catalytic activation.

Beyond the specific case of plant PLDs, this work will provide fundamental insights into the functioning of C2 domains and, more broadly, into the regulatory mechanisms governing protein–membrane interactions mediated by this domain.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Début de la thèse : 01/10/2026

Contrat doctoral

Concours pour un contrat doctoral

Université Claude Bernard Lyon 1

205 EDISS - Interdisciplinaire Sciences-Santé

Master 2 ou Ingénieur en Biochimie, Chimie, Biologie Structurale, Biologie Moléculaire, Biophysique. Une expérience en expression et purification des protéines ou spectroscopie RMN serait un plus, mais non essentiel.
Engineering degree in Biochemistry, Chemistry, Structural Biology, Molecular Biology, or Biophysics. Experience in protein expression and purification or NMR spectroscopy would be a plus but is not required.