Exploration du rôle du domaine C2 dans l’interaction de la phospholipase D avec la membrane par une approche structurale multi-échelle

La phospholipase D (PLD) est enzyme interfaciale impliquée dans l’hydrolyse des phospholipides membranaires. Le produit de lipolyse, l’acide phosphatidique est un second messager impliqué dans l’activation de nombreuses voies de signalisation cytosoliques et membranaires. La région N-terminale des isoformes de PLD de plantes contient un domaine C2, qui permettrait une interaction calcium-dépendante avec les membranes et régulant ainsi l’activité catalytique de ces enzymes en présence d’effecteurs tels que certains lipides anioniques, notamment le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP₂). Le domaine C2 est largement conservé au cours de l’évolution et se retrouve dans de nombreuses protéines eucaryotes, notamment humaines, impliquées dans les processus de signalisation et/ou interagissant avec les phospholipides, telles que la protéine kinase C, la phospholipase A₂ cytosolique, la phospholipase Cd1, la synaptotagmine et certaines protéines du trafic vésiculaire.

Une question centrale demeure cependant ouverte : comment la reconnaissance membranaire par le domaine C2 contrôle-t-elle l’orientation de l’enzyme aux interfaces, l’accessibilité du site actif et l’efficacité catalytique ? Les bases moléculaires du couplage entre l’ancrage membranaire et la catalyse restent largement méconnues. À ce jour, les données structurales disponibles sur les isoformes de PLD sont très limitées. Dans ce contexte, ce projet de thèse vise à utiliser les deux isoformes de PLD d’Arabidopsis thaliana (AtPLDα et AtPLDβ) comme modèles pour explorer les mécanismes universels de reconnaissance membranaire par les domaines C2.

Ces PLD ainsi que chaque domaine C2 isolé seront produits par expression recombinante, purifiés et marqués isotopiquement. Les interactions avec des membranes biomimétiques seront étudiées par RMN afin de caractériser, à l’échelle atomique, l’effet du calcium, du PIP₂ et de la composition lipidique sur l’affinité membranaire, la spécificité lipidique et la dynamique conformationnelle. Des approches complémentaires (dichroïsme circulaire, SEC-MALS, films monomoléculaires en cuve de Langmuir) permettront d’analyser la stabilité, l’oligomérisation et les propriétés interfaciales de la PLD et de son domaine C2 isolé. Enfin, une approche intégrative combinant RMN et cryo-microscopie électronique sera développée afin de décrire l’organisation des enzymes complètes à la membrane et les réarrangements structuraux associés à l’activation catalytique.

Ce projet de recherche s’inscrit dans la continuité des travaux menés lors de la thèse de Renaud Rahier, consacrés à la caractérisation fonctionnelle des domaines C2 N-terminaux de AtPLD (Rahier et al. Biomed Res Int. 2016, doi: 10.1155/2016/2721719, Arhab et al. BBA-MCBL. 2019. doi: 10.1016/j.bbalip.2019.01.008). Ces travaux ont montré que les domaines C2 des isoformes AtPLDα et AtPLDβ interagissent de manière sélective avec plusieurs phospholipides anioniques en présence de calcium. Ils ont également mis en évidence des différences marquées entre ces isoformes quant à leur sensibilité au calcium et à leurs préférences lipidiques, suggérant des mécanismes distincts de ciblage membranaire et de régulation enzymatique.

Malgré ces avancées, les bases structurales fines et la dynamique moléculaire de ces interactions membrane-protéine demeurent encore largement méconnues, en particulier dans des environnements membranaires plus complexes mimant les membranes biologiques. Dans ce contexte, le présent projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes de reconnaissance lipidique et d’activation des PLD en combinant approches structurales et biophysiques à haute résolution, afin de décrypter comment le calcium et la composition membranaire contrôlent le recrutement et la fonction de ces enzymes clés de la signalisation lipidique.

Au-delà du cas des PLD de plantes, ce travail apportera des connaissances fondamentales sur le fonctionnement des domaines C2 et, plus largement, sur les mécanismes de régulation gouvernant l’interaction des protéines avec les membranes via ce domaine.

L'encadrement de la thèse se déroulera dans un environnement favorisant le travail d'équipe et les échanges culturels. Cette thèse sera dirigée par Pr. Abousalham Abdelkarim et co-encadrée par Dr. Mouhand Assia, nouvellement recrutée. La thèse s’effectuera au sein de l’Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS-UMR5246 CNRS Université Lyon 1). L'ICBMS est un laboratoire multidisciplinaire à l’interface de la chimie, de la biochimie et de la biologie. Il se structure autour de quatre axes, dont l’axe ‘Biochimie et Biologie Moléculaire’ qui se concentre sur la compréhension des mécanismes moléculaires et des interactions entre les molécules et les composants cellulaires. L'équipe dans lequel le ou la candidat(e) sera intégrée est l'équipe GEMBAS (‘Génie Enzymatique, Membranes Biomimétiques et Assemblages Supramoléculaires’ ) qui s’intéresse, entre autres, aux mécanismes moléculaires de la lipolyse enzymatique. Un des objectifs de ces études est d'élucider la relation structure/fonction des lipases et phospholipases qui jouent un rôle clé dans le métabolisme lipidique, la signalisation cellulaire et la dynamique membranaire.

Master 2 ou Ingénieur en Biochimie, Chimie, Biologie Structurale, Biologie Moléculaire, Biophysique. Une expérience en expression et purification des protéines ou spectroscopie RMN serait un plus, mais non essentiel.