De la sous-unité à la capside : étude de l'enpaquetage dans un environnement cellulaire par différentes méthodes optiques à l'échelle de l'objet unique // From a single subunit to a single capsid: encapsulation in a cellular environment studied by single-

Les virus sont des agents biologiques remarquables, constitués d'un génome encapsulé dans une capside formée de centaines de blocs élémentaires assemblés avec une précision atomique. Leur régularité est particulièrement frappante, car pour de nombreux virus, elle se manifeste spontanément par un processus d'auto-assemblage. Cependant, la dynamique de ce processus reste peu documentée, bien qu'une meilleure compréhension permettrait d'approfondir nos connaissances sur le cycle de vie des virus et aiderait à la conception de nanovecteurs bio-inspirés pour le transfert de gènes ou la délivrance ciblée de médicaments.

En collaboration avec l'équipe de Guillaume Tresset (LPS, Orsay), nous avons récemment publié une méthode utilisant la microscopie de fluorescence à molécule unique pour observer en temps réel la dynamique d'équilibre de l'empaquetage du génome viral dans sa capside [1]. Cette méthode permet d'accéder à des quantités thermodynamiques pertinentes, telles que la constante d'association, le temps de résidence moyen des protéines et leurs lois de distribution, toutes estimées avec une précision sans précédent.

Jusqu'à présent, les expériences ont été menées dans des solutions salines, qui ne représentent pas complètement l'environnement intracellulaire où s'assemble la capside. De plus, en raison du photoblanchiment, notre technique nécessite une optimisation pour étudier l'assemblage autour d'un matériel génétique nu, c'est-à-dire la dynamique hors équilibre.

Le premier objectif de cette thèse est de suivre les étapes initiales de l'assemblage, jusqu'à la formation d'une capside virale, incluant le conditionnement du matériel génétique. Pour cela, nous utiliserons une pince magnétique Cette spectroscopie de force, à l'échelle de la molécule unique, complète la microscopie de fluorescence, car elle permet de surveiller l'empaquetage sous tension constante et de caractériser la stabilité de ce complexe empaqueté lors d'un saut de force [2]. Cette étude se déroulera dans le laboratoire de David Dulin à la VU Amsterdam. David Dulin est un expert de renommée mondiale dans les techniques de biophysique à molécule unique, telles que les pinces magnétiques à haut débit, et leur combinaison avec la microscopie TIRF, pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques. De plus, le laboratoire de D. Dulin fait partie de la section Physique du Vivant, où les premières recherches sur l'empaquetage du génome viral à l'aide de pinces optiques ont été réalisées [3,4], offrant ainsi un environnement exceptionnel pour l'encadrement du doctorant. L'objectif de cette proposition est de déployer les capacités de multiplexage de la pince magnétique de D. Dulin pour étudier l'empaquetage du génome dans divers environnements denses imitant le milieu intracellulaire.

Ensuite, au LuMIn, en collaboration avec G. Tresset, nous étudierons l'effet de la densité sur la dynamique d'équilibre. Pour mieux évaluer la taille des objets formés, nous combinerons la microscopie TIRF avec un système de microscopie de diffusion interférométrique (iSCAT), qui permet la visualisation en temps réel de protéines marquées et non marquées par diffusion de la lumière. Cette seconde méthode sans marquage révèlera la taille précise des capsides formées, avec une sensibilité à la protéine unique grâce à la microscopie de fluorescence.
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Viruses are remarkable biological agents composed of a genome encapsulated within a capsid shell made by hundreds of elementary building blocks assembled with atomic precision. Their regularity is especially noteworthy, as for many viruses, it arises spontaneously through a process of self-assembly. However, the dynamics of this process remain poorly documented, even though a deeper understanding would enhance our knowledge of the viral life cycle and assist in designing novel bioinspired nanovectors for gene transfer or targeted drug delivery.
In collaboration with Guillaume Tresset's team (LPS, Orsay), we recently published a method where we employed single-molecule fluorescence microscopy to monitor in real-time the equilibrium dynamics of the packaging of the viral genome within a viral capsid [1]. This method grants access to relevant thermodynamic quantities, including the average binding time, the mean residence time of proteins, and their distribution laws, all estimated with unprecedented precision.
So far, experiments have been conducted in saline solutions, which are not fully representative of the intracellular environment where the capsid assembles. Additionally, due to photobleaching, our technique requires optimization to study the assembly around bare genetic material, meaning the dynamics out of equilibrium.
The first objective of this thesis is to track the initial stages of assembly, up to the formation of a viral capsid, including the packaging of genetic material. For this, we will use a magnetic tweezers assay, a single-molecule force spectroscopy approach that complements fluorescence microscopy as it is able to monitor the packaging under constant tension and characterize the stability of such packaged complex upon force jump [2]. This study will take place in David Dulin's laboratory at the VU Amsterdam. David Dulin is a world-class expert in single-molecule biophysics techniques such as high-throughput magnetic tweezers, their combination with TIRF microscopy, to investigate protein-nucleic acids interactions. Furthermore, the Dulin lab is embedded within the Physics of Living section, where the investigations of viral genome packaging using optical tweezers were pioneered [3,4], and therefore benefits from an outstanding environment for the supervision of the PhD candidate. The aim of the proposal is to multiplexing capabilities of Dulin's magnetic tweezers assay to study genome packaging in various crowded environments that mimic the intracellular medium.
Next, at LuMIn, in collaboration with G. Tresset, we will study the effect of crowding on equilibrium dynamics. To better assess the size of the formed objects, we will combine TIRF microscopy with an interferometric scattering microscopy (iSCAT) system, which enables real-time visualization of fluorescently labeled and unlabeled molecules through light scattering. This second label-free method will reveal the accurate size of the formed capsids, with single-protein sensitivity provided by fluorescence microscopy.
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Début de la thèse : 01/10/2025

Programme COFUND LIGHTinPARIS

Université Paris-Saclay GS Physique

572 Ondes et Matière

La personne recrutée devra avoir une formation en physique ou biophysique, avec un intérêt fort pour l'optique instrumentale, les systèmes biologiques, et la programmation en Python. Un excellent niveau d'anglais écrit et parlé est essentiel. Un niveau même basique de français serait appréciable.
The PhD student to be recruited should have a background in physics or biophysics, with a strong interest in instrumental optics, biological systems, and Python programming. A good level of English (both spoken and written) is essential. A basic level in French will be appreciated.