Etude des mécanismes d'assemblage de la chaperone HSP90/R2TP // Mechanisms of Macromolecular Complex Assembly by the Chaperone HSP90/R2TP

L'homéostasie protéique repose sur l'équilibre entre la synthèse des protéines, leur repliement correct et leur dégradation, processus qui sont régulés de façon coordonnée par l'ensemble des facteurs impliqués dans le Contrôle Qualité des Protéines (PQC). Notre équipe a montré, avec d'autres, que la co-chaperone R2TP, associée à HSP90, joue un rôle essentiel et unique dans l'homéostasie protéique en assurant l'assemblage ordonné de complexes macromoléculaires, qu'il s'agisse de particules ribonucléoprotéiques (RNPs), telles que les sn/snoRNPs ou les miRNPs, ou de machineries multiprotéiques, telles que les ARN polymérases ou les PIKKs (1,2). Ces complexes macromoléculaires, qui sont appelés « clients » d'HSP90/R2TP, sont des acteurs essentiels de la prolifération et de la croissance cellulaires (3,4). En accord avec ces données, les membres du complexe HSP90/R2TP sont surexprimés dans de nombreux cancers et sont requis pour la tumorigenèse chez la souris (5).

La manière dont les différentes sous-unités des complexes clients sont recrutées par le R2TP, dans quel ordre, à quel endroit, et le mécanisme d'assemblage lui-même, ne sont pas bien compris. Le projet de thèse a pour but de détailler les mécanismes d'assemblage des clients de la chaperone HSP90/R2TP et s'articule autour de 4 axes principaux :

(i) Caractériser de façon systématique les différents intermédiaires d'assemblage par DIP-MS (Deep Interactome Profiling by Mass Spectrometry), une approche qui combine l'immunoprécipitation du R2TP, suivie de la séparation des sous-complexes partenaires sur gel natif et l'identification par spectrométrie de masse des protéines présentes dans chaque sous-complexe. Ces expériences seront réalisées dans des conditions qui bloquent l'assemblage des clients du R2TP à différentes étapes, par exemple en inhibant son activité ATPase par une drogue (5) ou en induisant sa dégradation ponctuelle avec un système dTAG (déjà disponible dans l'équipe).

(ii) Une approche complémentaire, plutôt que d'inhiber l'activité du R2TP lui-même, sera de muter sur les clients les sites de liaison du R2TP, notamment les sites DSDD/E phosphorylés connus pour interagir avec PIH1D1, l'un des membres du R2TP. L'effet de ces mutations sur l'interaction de ces sous-unités clientes avec le R2TP et leur assemblage avec leurs partenaires sera analysé par différentes approches (notamment AP-MS classique et DIP-MS, comme en (i)).

(iii) Caractériser les interactions identifiées au sein des sous-complexes d'assemblage par double hybride et par une approche innovante de cross-link in vivo couplé à l'analyse par spectrométrie de masse des peptides crosslinkés. Ceci permettra d'évaluer l'architecture moléculaire des complexes intermédiaires d'assemblage. Des modèles 3D de ces complexes seront obtenus par Alphafold et testés par mutagenèse. Ceci éclaircira les mécanismes d'assemblage utilisés par le R2TP.

(iv) Explorer le rôle du R2TP et la dynamique d'assemblage de ses clients en condition de reprogrammation traductionnelle comme lors d'un stress nutritionnel. L'étudiant.e en thèse analysera en particulier les nombreux clients du R2TP jouant un rôle dans la croissance cellulaire via leur action essentielle dans la transcription, la maturation des ARN et la biogenèse des ribosomes.

Les résultats obtenus devraient éclaircir le mode de recrutement et les mécanismes d'assemblage des complexes clients de la chaperone HSP90/R2TP. Ils permettront également de mieux comprendre comment le processus d'assemblage de ses clients est coordonné et régulé dans différentes conditions de croissance cellulaire, et contribue à une prolifération cellulaire normale et pathologique.
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Cellular protein homeostasis (= proteostasis) is based on the balance between protein synthesis, folding and degradation, processes that are regulated in a coordinated manner by all the factors involved in Protein Quality Control (PQC). Among others, our team has shown that the co-chaperone R2TP, associated with HSP90, plays an essential role and unique role in proteostasis by ensuring the orderly assembly of macromolecular complexes, either ribonucleoprotein particles (RNPs), such as sn/snoRNPs, or multiprotein machineries, such as RNA polymerases or PIKKs1,2. These macromolecular complexes, which are called HSP90/R2TP “clients”, are essential players in cell proliferation and growth3,4. In agreement with these data, members of the HSP90/R2TP complex are overexpressed in many cancers and are required for tumorigenesis in mice5.
How the different subunits of the client complexes are recruited by the R2TP, in what order, at what location, and the assembly mechanism itself, are not well understood.
The thesis project aims to detail the assembly mechanisms of HSP90/R2TP chaperone clients and is structured around four main axes:

(i) Systematically characterize the different assembly intermediates by DIP-MS (Deep Interactome Profiling by Mass Spectrometry), an approach that combines R2TP immunoprecipitation, followed by separation of partner subcomplexes on native gel and mass spectrometry identification of the proteins present in each subcomplex. These experiments will be carried out under conditions that block the assembly of R2TP clients at different stages, for example by inhibiting its ATPase activity with a drug5 or by inducing its transient degradation with a dTAG system (already available in the team).

(ii) A complementary approach, rather than inhibiting the activity of R2TP itself, will be to mutate R2TP binding sites on clients, including phosphorylated DSDD/E sites known to interact with PIH1D1, one of the R2TP members. The effect of these mutations on the interaction of these client subunits with R2TP and their assembly with their partners will be analyzed by different approaches (including classical AP-MS and DIP-MS, as in (i)).

(iii) Characterize the interactions identified within the assembly subcomplexes using two-hybrid assays and an innovative in vivo cross-linking approach coupled with mass spectrometry analysis of cross-linked peptides. This will allow for the assessment of the molecular architecture of the intermediate assembly complexes. 3D models of these complexes will be obtained using Alphafold and tested by mutagenesis. This will shed light on the assembly mechanisms used by R2TP.

(iv) Explore the role of R2TP and the assembly dynamics of its clients under conditions of translational reprogramming such as nutritional stress. The PhD student will specifically analyze the numerous R2TP clients that play a role in cell growth through their essential role in transcription, RNA maturation, and ribosome biogenesis.

The results obtained should shed light on the recruitment mode and assembly mechanisms of HSP90/R2TP chaperone client complexes. They will also provide a better understanding of how the assembly process of its clients is coordinated and regulated under different cell growth conditions and contributes to normal and pathological cell proliferation.
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Début de la thèse : 01/10/2025

Contrat doctoral

Concours pour un contrat doctoral

Université de Montpellier

168 Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé

Le candidat doit avoir une Maîtrise de Biologie avec de bonnes connaissances en Biologie Moléculaire et Cellulaire. Il/elle doit être curieux et motivé par la recherche fondamentale, tant au niveau théorique qu'expérimental. Il/elle travaillera dans une Institution où la recherche est de haut niveau, et il est attendu qu'il/elle s'implique à un degré élevé dans son projet de recherche.
The candidate should have a Master degree in Biology and a good knowledge of Molecular and Cellular Biology. He/she should be curious and highly motivated by fundamental research, both at the theoretical and experimental levels. He/she will work in a top level research Institution, and a high degree of dedication to research is expected.